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質(zhì)粒的制備

更新時(shí)間:2012-05-16      瀏覽次數(shù):1781


 
電泳檢驗(yàn)測定:質(zhì)粒電泳普通有三條帶,作別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型

吸光值檢驗(yàn)測定:認(rèn)為合適而使用分光光度計(jì)檢驗(yàn)測定260nm、280nm波長吸光值,若吸光值260nm/280nm的比率介于1.7-1.9之間,解釋明白質(zhì)粒品質(zhì)較好,1.8為*,低于1.8解釋明白有氨基酸污染,大于1.8解釋明白有RNA污染。

實(shí)驗(yàn)材料:包括質(zhì)粒pUC18載體的結(jié)腸桿菌菌液,克隆有稻子外源斷片的BAC的結(jié)腸桿菌菌液電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

實(shí)驗(yàn)原理:在pH 12.0 ~ 12.6堿性背景中,球菌的線性大分子量染色體DNA改變性別分開,而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒DNA固然改變性別但仍處于拓?fù)鋽嚁_狀況。將pH調(diào)至中性并有高鹽存在及低溫的條件下,大多染色體DNA、大分子量的RNA和氨基酸在去污劑SDS的效用下形成沉淀,而質(zhì)粒DNA還是為可溶狀況。經(jīng)過離心,可去掉除掉大多細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及氨基酸,質(zhì)粒DNA尚在上清中,而后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步醇化質(zhì)粒DNA。

實(shí)驗(yàn)步驟:

1.取包括pUC18質(zhì)粒的結(jié)腸桿菌菌液于LA營養(yǎng)物質(zhì)上真空干燥箱37℃過夜培育;

2.汲取1.5 ml菌液,12000 g離心2分鐘,使聚在一起菌體,倒掉菌液;汲取1.5 ml菌液,再次使聚在一起菌體,盡力將菌液倒整潔;

3.參加300 ml溶液 I振動(dòng)打勻,從新懸浮細(xì)胞,震動(dòng)混電熱鼓風(fēng)干燥箱勻(注意:應(yīng)*打勻沉淀或碎塊);

4.用無菌牙簽兒挑取單菌落,接種于包括Amp抗生素的LB營養(yǎng)物質(zhì)中,37℃搖床~250 r/min過夜培育;

5.參加300 ml溶液III顛倒混勻,安放于冰上10分鐘,使雜質(zhì)充分沉淀;

6.參加300 ml溶液II,輕柔顛倒混勻,安放至清脆,普通不超過5分鐘;

7.12000 g離心10分鐘;

8.汲取800 ml上清液(注意:不要汲取到漂浮的雜質(zhì))至另一Eppendorf管中,參加2/3大小的異丙醇,室溫下安放5分鐘干燥箱;

9.質(zhì)粒、BAC的品質(zhì)檢驗(yàn)測定,于-20℃保留。

10.倒盡上清,加75酒精浸洗除鹽(安放一會(huì)兒或離心3分鐘后倒去上清);

11.12000 g 常溫離心15分鐘;

12.室溫安放或超凈臺(tái)上風(fēng)干DNA;

13.加40 ml滅菌超純水或TE溶解;


 
 
 

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